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    蛋白的3種提取方法

    更新時間:2022-05-17  |  點擊率:2847
      1.單層貼壁細胞總蛋白的提取
     
      倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。
     
      每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS(0.01M pH=7.2~7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
     
      按1ml裂解液加10μl PMSF(100mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)
     
      每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。
     
      裂解完后,用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(動作要快),然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)
     
      于4℃下12000 rpm離心5min。(提前開離心機預冷)將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于-20℃保存。
     
      
     
      2.組織中總蛋白的提取
     
      將少量組織塊置于1~2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
     
      加400μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中,進行勻漿。然后置于冰上。
     
      幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
     
      裂解30min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在4℃下12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。
     
      加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取由于受藥物的影響,一些細胞脫落下來,所以除按1)操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。
     
      
     
      3.培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取
     
      將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,于2500 rpm離心5min。
     
      棄上清,加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500 rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。
     
      用槍洗干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
     
      將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。
     
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